母体孕期维生素D状况与胎儿宫内生长受限的关联研究

【摘要】宫内生长受限(intra-uterinegrowthrestriction,IUGR)是指胎儿宫内生长未达其遗传的生长潜能,临床上通常指小于胎龄儿(SGA),即新生儿出生体重低于同胎龄同性别平均出生体重的第10百分位数或两个标准差。IUGR是造成围产期胎儿／婴儿死亡的主要原因之一。不仅如此,IUGR还与成年期健康密切相关,国内外大量研究证实,IUGR儿成年后易患肥胖、Ⅱ型糖尿病和心血管疾病等疾病。维生素D在调节钙磷平衡中发挥关键作用,孕期维生素D缺乏普遍存在。近年来,母体孕期维生素D状况与胚胎发育的关系逐渐受到国内外专家的重视。本研究在前期建立安徽合肥市单胎母婴出生队列基础上,深入探讨了孕期母体(亲)维生素D状况与宫内生长受限发生的关联。建立维生素D缺乏动物模型,探讨母鼠维生素D缺乏对胎盘和胎鼠宫内生长发育的影响,并阐明胎盘炎症在维生素D缺乏损害胎盘和胎鼠发育中的作用；基于前期建立炎症诱发IUGR的动物模型,进一步探讨母鼠孕期补充维生素D对炎症引起IUGR的拮抗效应及其分子机理。采用巢式病例-对照研究方法,对比SGA儿和正常对照儿胎盘炎症和VDR信号相关指标,在人体验证胎盘VDR信号下调、炎症反应与IUGR发生的关联。本研究对探讨IUGR的病因和发病机制,预防和控制人类IUGR的发生,以及促进临床的有效治疗提供科学依据。1.母体孕期维生素D状况与宫内生长受限关联的队列研究在前期成功建立以社区人群为基础的、规模为3658对安徽合肥单胎母婴出生队列基础上,用放射免疫法检测队列内所有孕妇孕期血清25-(OH)D水平,并分析血清25-(OH)D水平与新生儿出生体重的关联。结果发现：仅964名孕妇(母体)维生素D状况属充足(25-(OH)D≥30ng/ml,占26.35%),1289名属不充足(20ng/ml≤25-(OH)D<30ng/ml,占35.24%),1359名属缺乏(10ng/ml≤25-(OH)D<20ng/ml,占37.15%),46名属极度缺乏(25-(OH)D<10ng/mml,占1.26%)；此外,孕期母体血清25-(OH)D水平与新生儿出生体重呈正相关,线性相关系数为0.477(P<0.001)；母体维生素D水平为极度缺乏时,新生儿平均出生体重仅2430.1g(95%CI:2249.9g,2610.3g)；母体血清25-(OH)D水平由低至高分为十层,在25-(OH)D低于40ng/ml人群中,新生儿平均出生体重随母体孕期血清25-(OH)D水平升高而逐渐增加,且呈明显剂量-效应关系；然而,当25-(OH)D超过40ng/ml时,新生儿平均出生体重不再随母体血清25-(OH)D水平升高而增加。这些结果提示,母体孕期维生素D缺乏较为普遍,母体孕期25-(OH)D水平与新生儿出生体重呈正相关。以维生素D充足状况为对照,本研究进一步分析了母体孕期维生素D状况与LBW发生的关联强度,结果发现：当母体维生素D处极度缺乏状况时,52.17%(24/46)孕妇分娩的胎儿为LBW,相对危险度(RR)达125.74(95%CI：41.90,377.38)；当母体维生素D处缺乏状况时,3.38%(46/1359)孕妇分娩的胎儿为LBW,RR值为8.12(95%CI:2.93,22.74)；当母体维生素D处不足状况时,1.32%(17/1289)孕妇分娩的胎儿为LBW,RR值为3.18(95%CI：1.07,9.48)。调整母体孕前BMI、年龄、采血季节和采血孕期后用多因素非条件Logistic回归模型分析母体维生素D状况与LBW的相关性,结果发现：极度缺乏组相对比值比(OR)为275.33(95%CI：87.55,865.84)、维生素D缺乏组OR值为8.06(95%CI：2.89,22.49)、维生素D不足组OR值为3.12(95%CI:1.05,9.31)。此外,本研究还分析了母体孕期维生素D状况与SGA发生的关联强度,结果发现：当母体维生素D处极度缺乏状况时,56.52%(26/46)孕妇分娩的胎儿为SGA,RR值为20.18(95%CI：10.92,37.31)；当母体维生素D处缺乏状况时,14.64%(199/1359)孕妇分娩的胎儿为SGA,RR值为5.23(95%CI：3.47,7.88)；当母体维生素D处不足状况时,5.59%(72/1289)孕妇分娩的胎儿为SGA,RR值为1.99(95%CI:1.27,3.13)。调整母体孕前BMI、年龄、采血季节和采血孕期后用多因素非条件Logistic回归模型分析母体维生素D状况与SGA的相关性,结果发现：极度缺乏组相对比值比(OR)为47.11(95%CI:23.36,95.00).维生素D缺乏组OR值为5.82(95%CI:3.85,8.78)、维生素D不足组OR值为2.03(95%CI：1.29,3.18)。这些结果表明,母体孕期维生素D缺乏不仅可增加LBW发生的风险,且可增加SGA发生的风险。2.母鼠孕期维生素D缺乏对胎盘和胎鼠发育的影响为探讨母鼠孕期维生素D缺乏对胎鼠发育的影响,雌鼠随机分为单纯维生素D缺乏组(VDD)和对照组。VDD组交配前2周至剖杀喂养低维生素D饲料,且过滤其光照紫外波段,对照组喂养标准饲料。所有孕鼠于妊娠第18天(gd18)处死,采血用放射免疫法检测血清25-(OH)D水平；记录活胎、死胎和吸收胎数,秤量活胎仔体重和胎盘重,测量身长,并评价活胎鼠骨骼发育情况。结果发现：VDD组母鼠血清25-(OH)D浓度显著低于对照组；与对照组相比,VDD组平均着床数和吸收胎数无明显差异,而平均每窝死胎数显著升高；VDD组胎鼠平均出生体重和身长显著低于对照组；母鼠维生素D缺乏显著延缓胎鼠尾椎骨骨化和引起胎鼠肋骨发育异常。此外,VDD组平均每窝胎盘重显著低于对照组。这些研究结果提示：母鼠孕期维生素D缺乏诱发胎鼠宫内生长受限。上述研究提示,母鼠孕期维生素D缺乏降低胎盘平均重量,本研究进一步探讨母鼠孕期维生素D缺乏对胎盘发育和功能的影响,孕鼠随机分为单纯VDD组和对照组,每组6只,所有孕鼠均于gd15处死,取胎盘组织,每只孕鼠各取1只胎盘常规固定石蜡包埋,每只孕鼠各取1只胎盘用实时定量RT-PCR法测物质转运体基因表达,余下胎盘储存于-80℃冰箱备用。结果发现：VDD组胎盘较小,较薄；VDD组胎盘迷路层厚度明显小于对照组,且发现VDD组胎盘迷路层血管紊乱,血细胞较少。进一步研究发现：VDD组胎盘葡萄糖转运体基因(glut1)、必需脂肪酸转运体基因(fatp4)和中性氨基酸转运体基因(snat2)mRNA水平显著低于对照组。这些结果提示,母鼠维生素D缺乏可导致胎盘发育受损和功能障碍。体外实验研究发现：人胎盘绒毛滋养细胞系(JEG-3细胞)加入1α,25-(OH)2D3孵育后,细胞GLUT1,FATP4和SNAT2mRNA水平与对照组相比无明显差异,提示维生素D缺乏可能是通过某种介质间接作用损害胎盘的发育和功能。一系列研究表明,母体炎症可损害胎盘发育和功能,本研究结果也显示：LPS显著下调JEG-3细胞GLUT1,FATP4和SNAT2基因表达；母鼠维生素D缺乏显著上调胎盘促炎细胞因子tnf-α、il-6、il-17α等和炎性趋化因子kc、mcp-1、mip-2基因表达；1α,25-(OH2D3预处理明显抑制LPS上调JEG-3细胞tnf-α和IL-6基因表达,此外,1α,25-（OH）2D3预处理明显对抗LPS下调JEG-3细胞GLUT1、FATP4和SNAT2基因表达。这些结果提示,母体孕期维生素D缺乏可能通过引起胎盘炎症继而损害胎盘发育和功能,最终导致宫内生长受限。为探讨胎盘炎症通过何种途径损害胎盘发育和功能,本研究检测了母体维生素D缺乏对胎盘细胞增殖的影响,结果发现：维生素D缺乏组胎盘海绵滋养层和迷路层的PCNA阳性细胞数均显著低于对照组,胎盘组织cyclinD1mRNA水平亦显著低于对照组。体外实验发现：JEG-3细胞经单纯1α,25-(OH)12D3处理后,与对照组相比,cyclinD1基因表达无明显差异,且发现细胞增殖亦无明显差异。IGF2、PGF和VEGF-A是调控胎盘发育的重要生长因子,本研究结果发现：维生素D缺乏组小鼠胎盘igf2,igf2r,pgf和vegf-αmRNA水平显著低于对照组；单纯1α,25-(OH)2D3处理对JEG-3细胞IGF2,IGF2R,PGF和VEGF-A基因表达无明显影响,但显著对抗LPS下调JEG-3细胞IGF2,IGF2R,PGF和VEGF-A基因表达；此外,1α,25-(OH)2D3预处理显著拮抗LPS引起的JEG-3细胞增殖减少,并对抗LPS下调cyclinD1基因表达。这些结果提示,维生素D缺乏可能通过引起胎盘炎症,继而抑制胎盘细胞增殖,导致胎盘发育受损和功能障碍。为探讨母体维生素D缺乏对炎症介导的IUGR的影响,VDD组和对照孕鼠各取半数于gd15-17每天经腹腔注射100μg/kg的LPS,余下半数孕鼠给予等量的生理盐水。gd18剖杀所有孕鼠,记录活胎、死胎和吸收胎数,秤量活胎仔体重和胎盘重,测量身长,并评价活胎鼠骨骼发育情况。结果发现：试验剂量范围的LPS无明显母体毒副作用,与单纯LPS组相比,VDD+LPS组着床数和吸收胎数无明显差异,但平均每窝死胎数显著升高,而活胎数显著降低；VDD+LPS组胎鼠平均出生体重和身长显著低于单纯LPS处理组；此外,VDD+LPS组平均胎盘重均显著低于单纯LPS组。这些结果表明,母体孕期维生素D缺乏可加重炎症介导的胎盘发育损害和IUGR。综上所述,本部分研究提示,母体孕期维生素D缺乏可能通过引起胎盘炎症,继而抑制胎盘细胞增殖,导致胎盘发育受损和功能障碍,最终诱发IUGR。3.母鼠孕期补充维生素D对炎症介导的胎盘和胎鼠发育损害影响上述研究表明,胎盘炎症在维生素D缺乏损害胎盘和胎鼠发育中起重要作用。LPS是炎性介质,本课题拟采用LPS建立炎症模型,探讨母鼠孕期补充维生素D对炎症引起胎盘和胎鼠发育损害的影响。孕鼠随机分组,除对照组外,所有孕鼠均于gd15经腹腔注射给予100μg/kg的LPS,VitD+LPS处理组于LPS处理前24h和1h经灌胃各给予25μg/kg的维生素D(VitD),对照组给予等容量的生理盐水或VitD。部分孕鼠于LPS处理后2h处死,取母体血清和胎盘组织。结果发现：单纯维生素D处理组血清TNF-α和IL-6水平与对照组相比无明显差异,单纯LPS处理后,血清TNF-α和IL-6水平显著升高,VitD+LPS处理组血清TNF-α和IL-6水平明显低于单纯LPS处理组；单纯维生素D处理组胎盘促炎性细胞因子tnf-αil-1β、il-6、il-12和趋化因子mip-2、kc、mcp-1mRNA水平与对照组相比无明显差异,维生素D预处理显著抑制LPS上调胎盘促炎性细胞因子和趋化因子基因表达；维生素D预处理显著抑制LPS上调胎盘iNOS基因表达。这些结果提示,母体孕期补充维生素D对抗LPS引起的炎症反应。余下孕鼠于LPS处理后12h剖杀,取胎盘组织,结果发现：与对照组相比,单纯维生素D处理组胎盘glutl、fatp4、snat2、igf2和igf2rmRNA水平无明显差异,而维生素D预处理显著抑制LPS下调glutl、fatp4、snat2、ig/2和igf2r基因表达。这些结果提示,母鼠孕期补充维生素D可减轻炎症介导的胎盘发育受损和功能障碍。本研究进一步探讨了补充维生素D对炎症介导胎鼠发育损害的影响。孕鼠随机分组,除对照组外,所有孕鼠均于gd15-17每天经腹腔注射给予100μg/kg的LPS,VitD+LPS处理组于LPS处理前24h和1h经灌胃各给予25μg/kg的VitD,对照组给予等容量的生理盐水或VitD。所有孕鼠均于gd18处死,记录吸收胎、活胎和死胎数,称量活胎体重,测量胎鼠身长,并对胎鼠骨骼发育情况进行评价。结果发现：试验剂量范围的维生素D(VitD)和LPS未见引起明显的母体毒副作用,维生素D预处理显著对抗LPS降低胎盘平均重量；进一步观察发现：各组之间胚胎着床数和吸收胎数无明显差异,与单纯LPS组相比,LPS+VitD组平均每窝死胎数显著下降,而活胎数显著增加,活胎鼠平均出生体重和身长显著升高；此外,孕期补充维生素D明显抑制LPS引起胎鼠骨骼发育迟缓。这些结果提示,母体补充维生素D可预防炎症诱发的胎鼠宫内死亡和宫内生长受限。上述研究表明,母体补充维生素D可对抗炎症介导的胎盘发育受损、功能障碍,继而预防炎症诱发的胎鼠宫内生长受限。4.维生素D发挥抗炎效应的分子机理本研究探讨了维生素D抑制LPS引起胎盘炎症的机制,孕鼠随机分组,除对照组外,所有孕鼠均于gd15经腹腔注射给予100μg/kg的LPS,VitD+LPS处理组于LPS处理前24h和1h经灌胃各给予25μg/kg的维生素D(VitD),对照组给予等容量的生理盐水或VitDo所有孕鼠均于LPS处理后2h处死,取胎盘组织。本研究首先检测了维生素D对TLR4信号的影响,结果发现：单纯维生素D处理组胎盘tlr4mRNA水平和MyD88蛋白含量与对照组相比无明显差异,VitD+LPS处理组tlr4mRNA水平与MyD88蛋白含量与单纯LPS处理组相比也无明显差异。这些结果表明,维生素D并非通过影响tlr4和MyD88而达到抗炎效应。本研究进一步检测了MyD88下游MAPKs信号、PI3K/Akt信号和NF-κB信号,结果发现：VitD+LPS组与单纯LPS组相比,胎盘磷酸化p38(pp38)蛋白和磷酸化Erkl/2(pErkl/2)蛋白水平无明显差异；VitD+LPS组pAkt蛋白水平反而显著高于单纯LPS组。此外,研究还发现,维生素D预处理显著对抗LPS激活胎盘NF-κBp65蛋白转核,维生素D显著对抗LPS激活胎盘NF-κB结合活性。本研究同时检测了母体维生素D缺乏对胎盘细胞核NF-κBp65蛋白含量的影响,结果发现：VDD组胎盘细胞核NF-κBp65蛋白水平显著高于对照组,表明母体孕期维生素D缺乏也可激活胎盘NF-κB信号。NF-κB抑制因子a(IκBα)主要与NF-κB在细胞浆结合抑制后者的转录活性,本研究发现,VitD+LPS组IκBα磷酸化水平(pIKBa)与单纯LPS组相比并无明显下降,因此推测维生素D可能并非完全通过对抗IκBα的磷酸化而抑制NF-κB信号。维生素D主要通过维生素D受体(VDR)发挥生物学效应,VDR是一种活性核受体,在人和小鼠胎盘组织广泛表达。本研究探讨了VDR在维生素D抑制胎盘NF-κB信号中发挥的作用,结果发现：母体维生素D缺乏对胎盘VDR表达无明显影响,但胎盘细胞核蛋白含量显著下降。体外实验研究发现：1α,25-(OH)2D3预处理显著抑制LPS激活JEG-3细胞NF-κBp65转位入核,且可抑制LPS上调细胞TNF-α和IL-6基因表达；通过转染VDRsiRNA可沉默VDR信号,沉默VDR信号后,1α,25-(OH)2D3预处理对LPS激活JEG-3细胞NF-κBp65转位入核无明显抑制作用,且对LPS上调细胞TNF-a和IL-6基因表达也无明显抑制作用。这研究提示,维生素D可能通过VDR依赖途径抑制胎盘NF-κB信号。本研究进一步探讨了VDR抑制NF-κB信号的机制,结果发现：维生素D处理可显著上调小鼠胎盘组织和人胎盘滋养细胞VDR表达,以及细胞核内活性VDR蛋白水平；维生素D处理可显著上调VDR靶基因cyp24al和CYP3A4的基因表达。提示维生素D处理可激活胎盘VDR信号。结果还发现：LPS处理可激活胎盘NF-κB信号,但显著抑制小鼠胎盘及人胎盘滋养细胞VDR信号,且对抗维生素D激活小鼠胎盘及人胎盘滋养细胞VDR信号。提示胎盘NF-κB的激活可抑制胎盘VDR信号。因此,本研究推测VDR与NF-κB可能具有相互结合作用。通过免疫沉降技术沉降小鼠胎盘组织及人胎盘滋养细胞VDR蛋白,检测NF-κBp65发现：LPS组和VitD+LPS组NF-κBp65蛋白水平显著高于对照组,表明VDR与NF-κBp65可相互结合。上述研究结果提示,LPS可对抗维生素D激活VDR信号,VDR与NF-κBp65具有相互抑制作用。综上所述,本部分研究提示：活性VDR与NF-κBp65可相互结合,维生素D可通过VDR依赖途径抑制胎盘NF-κB信号,继而预防炎症介导的IUGR。5.胎盘VDR信号和与宫内生长受限的关联研究为进一步验证胎盘VDR信号和宫内生长受限(IUGR)发生的关联,采用巢式病例-对照研究方法,比较SGA儿与出生体重正常的对照儿胎盘VDR信号,结果发现：VDR主要在胎盘绒毛滋养细胞高表达,SGA儿胎盘细胞核VDR蛋白水平显著低于对照组。提示胎盘VDR信号下调与IUGR的发生密切相关。此外,研究还发现,LBW组和SGA组母体血清25-(OH)D水平均显著低于对照组,提示母体血清25-(OH)D水平与胎盘VDR信号的关联。为验证胎盘炎症和母体炎症与IUGR发生的关联,采用巢式病例-对照研究方法,比较SGA组和对照组人胎盘细胞核内NF-κBp65的蛋白含量,比较LBW组和对照组母体血清TNF-a和IL-8水平,结果发现：SGA组胎盘核NF-κBp65蛋白水平显著高于对照组,提示胎盘炎症与IUGR的发生密切相关；LBW组母体血清TNF-a和IL-8水平显著高于对照组,提示母体炎症与IUGR的发生密切相关。综上所述,本部分研究进一步从人体上验证了胎盘VDR信号在调控孕期炎症和免疫反应过程中起关键作用。根据上述研究结果,本课题可得出如下结论：首次通过基于人群的大样本队列研究和动物试验证实母体孕期维生素D状况与IUGR发生的关联；基于人群的大样本队列研究表明,母体孕期维生素D缺乏不但可增加LBW发生风险,且可增加SGA发生的风险；母鼠孕期和孕期低维生素D饮食可导致胎鼠宫内生长受限。巢式病例-对照研究发现,SGA胎盘VDR信号显著下调,而NF-κB信号被显著激活；母鼠维生素D缺乏导致胎盘NF-κB信号显著激活并上调胎盘促炎因子和趋化因子基因表达,孕鼠补充维生素D可激活胎盘VDR信号,继而抑制胎盘NF-κB信号及其靶基因,并最终预防炎症介导的IUGR;总之,本研究提示,胎盘VDR信号在调节孕期炎症和免疫反应中可能起关键作用。
【作者】陈远华；
【导师】徐德祥；陶芳标；
【作者基本信息】安徽医科大学，儿少卫生与妇幼保健学，2014，博士
【关键词】队列研究；维生素D缺乏；维生素D受体；细菌脂多糖；宫内生长受限；核因子-κB；胎盘；JEG-3细胞；小鼠；

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